葡聚糖基質(zhì)凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)樹脂填料Smartdex G-10 蛋白分離

Smartdex G-10系列介質(zhì)是一類以葡聚糖為基質(zhì)的凝膠過(guò)濾層析（gel filtration chromatography）介質(zhì)，其工作原理主要是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的葡聚糖凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離。

  葡聚糖凝膠是一種具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物，它是由葡聚糖加入交聯(lián)劑通過(guò)醚鍵互相交聯(lián)聚合而成的，交聯(lián)度越大,網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)就越緊密，吸水后的體積膨脹就越小，能允許進(jìn)入凝膠內(nèi)部的分子的分子量也就越小，反之亦然。層析時(shí)，大于凝膠孔徑的大分子，被阻于凝膠相外，沿著凝膠顆粒之間的間隙走，下移速度最快,故最先洗脫下來(lái)，中分子物質(zhì)部份進(jìn)入凝膠內(nèi)部，洗脫速度為其次，而小分子物質(zhì)因全部進(jìn)入凝膠，受到阻力大，故最后被洗脫下來(lái)，如此物質(zhì)得到分離。

   型號(hào)G表明每克于凝膠吸水量的多少，例如G-10表明每克干凝膠吸水1.0克。這表征了凝膠所能膨脹的倍數(shù)，亦間接表征了凝膠孔徑的大小。

表1.Smartdex G-10產(chǎn)品性能

2.裝柱說(shuō)明

2.1凝膠的預(yù)處理

Smartdex G-10 為于粉，初次使用前必須進(jìn)行預(yù)處理。溶脹過(guò)程中嚴(yán)禁使用磁力攪拌，以免使微球破碎。

加入足夠的水或緩沖液進(jìn)行溶脹，室溫3h 以上或水浴 90℃、1h。如果室溫溶脹則需要進(jìn)行真空脫氣，然后將溶脹好的微球按照3∶1（v/v）加入水或緩沖液攪拌使其形成均勻的75%膠懸液。如果是重復(fù)使用的可以將 20%乙醇傾去，加水或緩沖液攪拌均勻成75%的膠懸液。

2.2 Smartdex G-10 的裝填

2.2.1重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，加入適量純水潤(rùn)洗柱管和墊片，關(guān)閉下出口。

2）將溶脹好的介質(zhì)混合均勻，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中（介質(zhì)實(shí)際體積占懸液的75%），打開下出口流干保護(hù)液。3）加入適量純水沖洗介質(zhì)，待柱管中液體重力流干后，關(guān)閉下出口。4）裝入潤(rùn)洗后的上墊片，確保墊片與填料之前沒有空隙，且保持水平。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡，暫不使用時(shí)則加入保護(hù)液，4-30℃保存。

2.2.2 層析柱的裝填

裝柱前根據(jù)層析柱直徑計(jì)算柱子底面積，根據(jù)所需裝柱高度計(jì)算所需介質(zhì)體積，公式如下∶

V=1.15mh

V∶所需介質(zhì)體積 ml 1.15∶壓縮系數(shù)r∶柱管半徑 cm h∶裝填高度 cm

注意∶介質(zhì)實(shí)際體積占所取懸液總體積的 75%。

1）用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭，確保柱底篩板上無(wú)氣泡，關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留出1-2cm 的去離子水。2）將填料懸浮起來(lái)，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3）如果使用儲(chǔ)液器，應(yīng)立即在層析柱和儲(chǔ)液器中加滿水，將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面，連接至泵上，避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。4）打開層析柱底部出口，開啟泵，使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過(guò)層析柱，然后緩慢增加至最終流速，這樣可避免液壓對(duì)所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，這樣也可以得到一個(gè)很好的裝填效果。（注意∶在隨后的色譜程序中，不要超過(guò)最大裝柱流速的75%）當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上3 倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。5）關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。

6）如果使用儲(chǔ)液器，去除儲(chǔ)液器，將分配器置于層析柱中。

7）將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭。8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

葡聚糖基質(zhì)凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)樹脂填料Smartdex G-10 蛋白分離過(guò)程

3.1 緩沖液的準(zhǔn)備

所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22 μm 或0.45 um 濾膜過(guò)濾。

平衡液為蛋白純化后，用干保護(hù)蛋白的溶液（例如;PBS等），根據(jù)客戶需求自行選擇。

3.2 樣品準(zhǔn)備

樣品在上樣前建議離心或用0.22 μm 或0.45 μm 濾膜過(guò)濾，減少雜質(zhì)，防止堵塞柱子。

3.3 樣品純化1平衡

上樣之前，用平衡液至少平衡 5-10個(gè)柱體積，或直到基線穩(wěn)定。含去垢劑的溶液可能需要平衡更長(zhǎng)時(shí)間。2）上樣和洗脫

推薦上樣體積為柱體積的 10%以內(nèi)。脫鹽時(shí)最大樣品量可至 30%柱體積。使用重力柱純化時(shí)。待樣品進(jìn)入填料后，繼續(xù)加入平衡液進(jìn)行洗

脫，使用預(yù)裝層析柱純化時(shí)，可以通過(guò)上樣管或樣品環(huán)來(lái)上樣。分管收集洗脫液，樣品進(jìn)入填料開始，按昭固定體積（例如 1ml/管）收集

樣品，檢測(cè)每管蛋白濃度和鹽濃度，計(jì)算回收率和脫鹽效率。預(yù)裝層析柱純化流速最高不能超過(guò)裝柱流速的 70%。

凝膠過(guò)濾是一種非吸附性色譜技術(shù)，所有的樣品物質(zhì)都應(yīng)在一個(gè)柱體積之內(nèi)洗脫出來(lái)。完成一次操作后，如仍用同一種緩沖液，色譜柱不需要再平衡。3）再生

再生通常用水沖洗2 倍柱體積，然后用緩沖液沖洗2-3倍柱體積，如果不立刻使用，則用20%乙醇平衡后，4-30℃C保存。對(duì)不同的樣品，建議大約5次循環(huán)后，采用完整的在位清洗（CIP）。

4.清洗及保存

在位清洗∶為除去變性蛋白或脂肪，有時(shí)需要對(duì)脫鹽柱進(jìn)行原位清洗。常用的清洗液為0.1-0.2 M NaOH 或非離子型去垢劑。

1）加入一倍的柱體積0.1-0.2 M NaOH，依靠重力或者低流速清洗介質(zhì)。

2）用足夠量的去離子水，沖洗介質(zhì)，直至 pH 值至中性。

3）用至少三倍柱體積 20%乙醇溶液沖洗介質(zhì)，然后做好色譜柱的密封，置于2-8℃保存。

注∶不建議介質(zhì)多次重復(fù)再生和使用。

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