懸浮細胞的電融合轉(zhuǎn)染技術
融合懸浮細胞的步驟與電穿孔的很類似，只是在進行高強度的電場脈沖前后，必須用低幅、高頻電場使細胞排成一條鏈。
1 用融合介質(zhì)（FM）洗懸浮細胞兩次，然后懸于FM中。洗滌細胞時，在臺式離心機上1000rpm下離心3分鐘，得到細胞沉淀，棄去上清液將細胞懸于新鮮FM介質(zhì)中。
2 將懸浮細胞轉(zhuǎn)移到相應的融合室內(nèi)。假如要使兩種不同的細胞彼此融合，轉(zhuǎn)移前要充分混合。
3 啟動介電電泳場，其振幅通常小于200V/cm，頻率在2MHz以內(nèi)，用顯微鏡檢測細胞是否排成一條鏈，調(diào)節(jié)振幅和頻率以達到最佳效果。
4 讓介電電泳場開約1分鐘后關掉，立即應用融合脈沖，其振幅數(shù)量級為1kV/cm。脈沖寬度小于1ms。在進行融合脈沖后立即再次啟動介電電泳場，常規(guī)讓其開啟約2分鐘。
5 關掉介電電泳場，讓細胞在樣品池中靜置10分鐘。
6 去掉FM，用普通培養(yǎng)基再次洗滌細胞。
7 將細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，加入普通培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱一般條件下培養(yǎng)。

[注意事項]
1 適宜組分依使用的特定細胞種類而有變化。如果努力優(yōu)化電壓和脈沖寬度電穿孔結(jié)果仍不令人滿意，就應嘗試改變穿孔介質(zhì)。
2 影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細胞狀態(tài)有關，為達到高效率，必須收集對數(shù)生長中期的細胞。
1.純化siRNA
在轉(zhuǎn)染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。
2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復性
通常，健康的細胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細胞，否則細胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。
4.避免使用抗生素
抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。
5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑
針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。
 6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件
對大多數(shù)細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。
7.通過標記siRNA來優(yōu)化實驗
熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導入了siRNA的細胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。

 蘇州阿爾法生物是一家集生命科學儀器設備、實驗耗材和實驗試劑供應于一身的專業(yè)公司。阿爾法生物產(chǎn)品覆蓋生命科學研究、生物制藥、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領域，包括的實驗室儀器設備有生物顯微鏡、細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、蛋白電泳系統(tǒng)、數(shù)字PCR儀、高通量分析儀、高速冷凍離心機、超速離心機、臺式高速離心機、低速離心機、落地式離心機、迷你離心機、真空濃縮儀、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、生物反應器、研磨儀等，實驗耗材常用的nest培養(yǎng)瓶、rainin移液槍tip頭、離心管、PCR管、8聯(lián)排管、三角搖瓶、培養(yǎng)皿等，實驗試劑包括天根試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、蛋白抗體、碧云天試劑、阿拉丁試劑、腫瘤細胞株、基因編輯細胞、支原體清除試劑盒等。阿爾法生物一直與國際生命科學儀器廠商以及一些新興科技公司保持著深度的合作關系，這也為產(chǎn)品供應和技術支持提供了有力保障。 作為十四年年專注于實驗室儀器設備、實驗耗材和實驗試劑供應商，無論是實驗室的常規(guī)使用，還是科研人員的前沿探索，阿爾法生物都能夠為您提供良好的軟硬件支持和快捷、周到的服務。更多實驗室儀器、實驗試劑、實驗室耗材采購相關問題請進入公司網(wǎng)站進行了解。