實(shí)驗(yàn)室常用 DNA 聚合酶有三種：TaqTM ， EXTaqTM 和 Pyrobest TM DNA Polymerase。TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶， 保真性較差 ， 但價(jià)錢便宜， 一般用于基因表達(dá)的檢測(cè)等。TaKaRa EXTaqTM 是具有 Proofreading 活性的耐熱性 DNA 聚合酶， 具有一定的保真性， 而且其擴(kuò)增得到的 PCR 產(chǎn)物 3 ’ 端附有一個(gè) “A" 堿基 ，如果希望直接將產(chǎn)物克隆 到 T-vector 可以用此酶 。 Pyrobest TM DNA Polymerase 也是具有 Proofreading 活性的耐熱性 DNA 聚合酶， 其特點(diǎn)是保真性高，擴(kuò)增得到的 PCR 產(chǎn)物為平滑末端。如果進(jìn)行基因的擴(kuò)增請(qǐng)使用此酶。
1. 按下列組成在 PCR 反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液：
TaKaRa TaqTM 或 TaKaRa EXTaqTM 的配方
Reagent | Quantity, for 50µl of reaction mixture |
10X PCR buffer （Mg2+ free） | 5 µ l |
MgCl2（25mM） | 如 TaKaRa TaqTM 加 3 µl |
如 TaKaRa EXTaqTM 加 4 µl | |
2.5mM dNTP mix | 4 µ l |
10µM Primer 上游 | 1 µ l |
10µM Primer 下游 | 1 µ l |
Template DNA | 1 µ l |
Taq 或 EXTaqDNA Polymerase | 0.25 µl |
Sterile deionized water | Up to 50µl |
Total | 50 µl /Sample |
merase 的配方
Reagent | Quantity, for 50µl of reaction mixture |
10X Pyrobest buffer | 5µ l |
2.5mM dNTP mix | 4µ l |
10µM Primer 上游 | 1µ l |
10µM Primer 下游 | 1µ l |
Template DNA | 1µ l |
Pyrobest TM DNA Polymerase | 0.25µl |
Sterile deionized water | Up to 50µl |
Total | 50µl /Sample |
① 反應(yīng)總體積根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)控，可以做 20~50µl 以節(jié)約試劑；
② 將上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 滅菌的 PCR 薄壁管中；
③ 如果不用 PCR 儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加 30 ~50µl 的礦物油防止樣品在 PCR 的過程中蒸發(fā)；
2. 按以下程序進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
PCR 反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異， 在實(shí)際操作中需根據(jù)具體的情況以及 PCR 結(jié)果而進(jìn)行優(yōu)化。
Step | Temperature, ° C |
Time, min | Number of cycles | Note |
起始變 性 |
94~95 |
1-3 |
1 | |
變性 | 94~95 | 0.5-2 |
25-35 | 退火溫度比理論退火 溫度大概低 5°C ，再 根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化 |
退火 |
37-70 |
0.5-2 | ||
延伸 |
70-75 | 根據(jù)擴(kuò) 增產(chǎn)物 的大小 | 每分鐘延伸 1000bp | |
最終延 伸 |
70-75 |
10 |
1 |
反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴(kuò)增樣品 5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用 DNA marker 判斷擴(kuò)增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。
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