初代測(cè)序技術(shù)分類 Maxam-Gilbert化學(xué)降解法測(cè)序 1. 測(cè)序原理：先對(duì)DNA片段的5'或3'端進(jìn)行放射性標(biāo)記，再采用特異性化學(xué)試劑修飾和裂解特定的堿基位點(diǎn)，從而得到一系列有共同放射起點(diǎn)但長(zhǎng)度不一的DNA片段混合物，通過(guò)對(duì)此混合物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳即可從放射自顯影片直接讀出DNA堿基序列。
2. 堿基序列的識(shí)讀：聚丙烯酰胺凝膠電泳可以將DNA片段混合物按片段大小分開(kāi)，片段越小越接近凝膠底部。因?yàn)榛瘜W(xué)降解反應(yīng)并非絕對(duì)的堿基特異性反應(yīng)，在識(shí)讀時(shí)需從A+G泳道中扣除G泳道的條帶而推斷A堿基，從C+T泳道中扣除C泳道的條帶而推斷T堿基，即若A+G泳道中出現(xiàn)一條帶且G泳道中有相同大小的帶，則識(shí)讀為G堿基，若G泳道中沒(méi)有相同大小的帶，則識(shí)讀為A堿基。
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圖1 化學(xué)降解法測(cè)序反應(yīng)示意圖
在不同點(diǎn)切割相同的DNA標(biāo)記片段會(huì)產(chǎn)生不同大小的標(biāo)記片段，然后通過(guò)凝膠電泳分離片段
但由于化學(xué)降解法測(cè)序技術(shù)對(duì)待測(cè)DNA要求較高、操作繁瑣、試劑毒性大、放射性標(biāo)記率偏低等原因，并未得到廣泛應(yīng)用。
Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序 1. 測(cè)序原理：以待測(cè)單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，隨機(jī)引入底物：4種dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)和4種ddNTP(ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP)。在DNA聚合酶的作用下，若引入dNTP則新生鏈繼續(xù)延伸，若引入ddNTP則新生鏈合成終止。因此反應(yīng)結(jié)束后體系中得到一系列長(zhǎng)度不一的DNA片段混合物，通過(guò)電泳對(duì)此混合物按分子量大小分開(kāi)即可讀出DNA堿基序列。
圖2 傳統(tǒng)（a） VS 改進(jìn)后（b）Sanger法測(cè)序原理示意圖
傳統(tǒng)Sanger測(cè)序采用放射性核素標(biāo)記引物，分成4管反應(yīng)體系，通過(guò)平板聚丙烯凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。而改進(jìn)后的Sanger測(cè)序采用熒光素標(biāo)記標(biāo)記ddNTP或標(biāo)記引物，熒光素標(biāo)記ddNTP時(shí)可實(shí)現(xiàn)4管反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，通過(guò)毛細(xì)管電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。
2. 堿基序列的識(shí)讀：通過(guò)電泳將DNA片段混合物按片段大小分開(kāi)，傳統(tǒng)Sanger測(cè)序利用放射自顯影技術(shù)，人工讀取結(jié)果：片段越小越接近凝膠底部，由底部向上依次讀出新合成鏈的5'→3'方向的DNA堿基序列。
而改進(jìn)后的Sanger測(cè)序利用熒光信號(hào)采集技術(shù)，自動(dòng)化讀取結(jié)果：片段越小越先通過(guò)熒光信號(hào)采集器，由通過(guò)時(shí)間的先后和熒光信號(hào)自動(dòng)記錄堿基序列。
初代測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)及應(yīng)用 Sanger測(cè)序法自面世以來(lái)經(jīng)過(guò)40年的不斷發(fā)展，讀長(zhǎng)可達(dá)1000bp，測(cè)序準(zhǔn)確度高達(dá)99%，是基因序列測(cè)定的金標(biāo)準(zhǔn)
[2]。但此法的局限在于：只適合對(duì)已知突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)且只能測(cè)出部分變異形式，如檢測(cè)點(diǎn)突變、小片段插入/缺失；通量低，導(dǎo)致需要獲得大量信息的成本較高；靈敏度較低，對(duì)于腫瘤樣本突變率低于10~15%的變異，檢出難度較大
[3]。
隨著精準(zhǔn)時(shí)代的到來(lái)，Sanger測(cè)序法仍在qPCR檢測(cè)和高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)果驗(yàn)證、鑒定、微生物種類鑒定和科研等各個(gè)方向發(fā)揮著重要作用。Sanger測(cè)序法為我們打開(kāi)了合成測(cè)序的大門(mén)，同時(shí)為大規(guī)?；蚪M測(cè)序的誕生奠定了基礎(chǔ)。
蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司提供的基因測(cè)序儀、凝膠成像儀、電泳儀、電泳槽、PCR擴(kuò)增儀等廣泛應(yīng)用于初代測(cè)序。
