外泌體是一種小的 (40-100 nm) 細(xì)胞外膜囊泡，目前進(jìn)行外泌體分離的普遍方法是差速離心法。
應(yīng)用差速離心法和粒徑分析等是細(xì)胞外囊泡 (EV) 研究的重要步驟。已知細(xì)胞會分泌許多膜囊泡，這些囊泡的大小、分子含量及其形成機(jī)制各不相同 具體取決于細(xì)胞的類型 和當(dāng)前狀態(tài)。通?？梢员鎰e出三個主要的 EV 群體：凋亡小體、脫落的囊泡和外泌體 . 凋亡小體是已知較大的囊泡，直徑為 800-5000 nm，由凋亡后細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜成分組成。脫落的囊泡和外泌體由非凋亡細(xì)胞釋放。脫落的囊泡，也稱為“胞外體"或有時稱為“微泡"，是由質(zhì)膜起泡產(chǎn)生的，一般的粒徑尺寸范圍為 (50– 1000 nm)。
外泌體是內(nèi)吞起源的小 (40–100 nm) 囊泡群。外泌體和脫落的囊泡都含有特定的蛋白質(zhì)組、RNA 和, dsDNA 等。不同的細(xì)胞外環(huán)境富含不同類型的細(xì)胞外囊泡。即使由相同的細(xì)胞類型形成，不同類別的囊泡也具有不同的核酸特征 。
差速離心法的原理
離心管內(nèi)粒子的速度，由三種力（離心力、阿基米德浮力和斯托克斯粘性阻力）的平衡決定，如：
其中g(shù)eff為離心力（加速度），R為旋轉(zhuǎn)半徑，即粒子距旋轉(zhuǎn)軸的距離，ω為旋轉(zhuǎn)角頻率，d為粒子直徑，ρ為質(zhì)量粒子的密度和 ρ solv和 η 分別是介質(zhì)的密度和粘度。
在固定的離心條件（轉(zhuǎn)速和介質(zhì)成分）下，粒子速度由粒子的形態(tài)和密度決定。密度高于介質(zhì)密度的粒子沿離心力“向下"運(yùn)動，而比介質(zhì)輕的粒子沿與離心力相反的方向“上浮"。對于相似的密度，較大的粒子遷移得更快。因此，在生物學(xué)中，離心主要用于按大?。ú钏俸退俾蕝^(qū)帶離心）或按密度（等密度離心）分離不同的物體。在這項研究中，我們專注于使用差速離心按大小進(jìn)行顆粒分級。
與等密度和梯度離心相反，差速離心從離心管內(nèi)顆粒的均勻初始分布開始。在開始一輪離心過程中，位于管底部附近的一部分目標(biāo)小顆粒不可避免地與較大顆粒共同沉淀。這種共沉淀導(dǎo)致較小顆粒的產(chǎn)量降低。然而，選擇大顆粒，起初位于管半月板附近，在開始一輪離心過程中可能沒有足夠的時間到達(dá)管底，從而污染最后一個離心步驟產(chǎn)生的小顆粒顆粒。
顯然，交叉污染的程度取決于不同粒子群的相對沉降速度和離心條件。在被分離的粒子的沉降速度之間存在顯著（數(shù)量級）差異的情況下，可以有效地優(yōu)化差速離心協(xié)議以獲得目標(biāo)粒子群的高產(chǎn)量和足夠純度。此外，當(dāng)不同顆粒部分之間的沉降速率僅存在微小差異時，優(yōu)化過程不太成功。在這些情況下，取決于離心條件。
任何外泌體分離方案旨在獲得產(chǎn)量合理且不受細(xì)胞碎片、細(xì)胞器和凋亡小體污染的外泌體群體，理想情況下，不含其他類型的細(xì)胞外囊泡、蛋白質(zhì)及其聚集體。由于大小差異很大，將外泌體與細(xì)胞、細(xì)胞碎片和大囊泡分離相對容易。巨大的挑戰(zhàn)是從小的脫落囊泡中純化外泌體，因為它們的大小非常相似。通過差速離心分離這些細(xì)胞外囊泡既困難又低效。所以需要根據(jù)轉(zhuǎn)子的特性和要分離的顆粒的特性，來對離心參數(shù)應(yīng)進(jìn)行調(diào)整。因為離心速度與粒子的旋轉(zhuǎn)半徑成正比，所以離心運(yùn)動加速。粒子的徑向坐標(biāo)隨時間t呈指數(shù)增長。
離心機(jī)轉(zhuǎn)子的選擇
使用差速離心法分離外泌體主要需要注意的是轉(zhuǎn)子的選擇。“擺動桶"(SW) 轉(zhuǎn)子和“定角"(FA) 轉(zhuǎn)子， 這些轉(zhuǎn)子的幾何形狀根本不同，因此沉降特性也不同。這些轉(zhuǎn)子之間的主要區(qū)別在于： FA 轉(zhuǎn)子，與旋轉(zhuǎn)半徑相比，沉積顆粒的較大路徑長度通常較小，允許近似恒定遷移率并簡化描述。然而，第二個區(qū)別是圓形 FA 管的水平橫截面是橢圓形的，不同粒子的路徑長度根據(jù)軌跡與橢圓長軸的距離而不同。由于較短的路徑長度，外圍顆?？赡艹两档酶欤枰鶕?jù)不同的實驗需要進(jìn)行選擇。
蘇州阿爾法生物提供的超速離心機(jī)、低速離心機(jī)、落地式離心機(jī)、臺式離心機(jī)、納米粒徑分析儀廣泛應(yīng)用于差速離心法分離外泌體及外泌體形態(tài)、電位、粒徑分析等實驗。
