人原代細(xì)胞是直接從組織中分離出來(lái)的細(xì)胞，包括外周血、臍帶血和骨髓。這些細(xì)胞因其在生物過(guò)程、疾病進(jìn)展和藥物開(kāi)發(fā)研究以及包括基于體外細(xì)胞的分析或創(chuàng)建異種移植或人源化小鼠模型在內(nèi)的應(yīng)用中的重要性而日益受到認(rèn)可。
如果不需要立即使用，新鮮的原代細(xì)胞通常會(huì)低溫保存（即冷凍），以便在液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。處理新鮮樣品資源有限的研究人員也可以 購(gòu)買(mǎi)冷凍的即用型原代細(xì)胞，包括單核細(xì)胞 (MNC)、純化的免疫細(xì)胞或造血干細(xì)胞。解凍冷凍細(xì)胞時(shí)，正確的技術(shù)和處理可確保細(xì)胞在下游應(yīng)用中的活力、恢復(fù)和功能。如何解凍冷凍的原代細(xì)胞?
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1. 添加了 10% 胎牛血清 (FBS)的 改良培養(yǎng)基（IMDM）
2. DMEM 含 4500 mg/L D-葡萄糖，添加了 10% FBS
3. RPMI 1640 培養(yǎng)基，添加了 10% FBS
4. 含 2% FBS 的磷酸鹽緩沖鹽水（例如含 2% 胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽）
5. 2 mL 血清移液管（例如nest 血清移液器，2 mL）
6. 25 mL 血清移液管（例如nest 血清移液管，25 mL）
7. 50 mL 錐形管（例如 nest離心管，50 mL）
8. DNase I 溶液 (1 mg/mL)（天根試劑）
9. 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（博大博聚）
10. 臺(tái)盼藍(lán)（索萊寶）
11. 移液器（瑞寧移液槍?zhuān)瑀ainin電動(dòng)助吸器）
12. 移液器吸頭（瑞寧，耐思）
13. 人原代細(xì)胞
注意事項(xiàng)：
在 37°C 水浴鍋中加熱培養(yǎng)基。如果解凍細(xì)胞用于下游細(xì)胞分離，可以使用含有 2% FBS 的 PBS。
從儲(chǔ)存中取出冷凍細(xì)胞時(shí)，重要的是盡量減少暴露于室溫 (15 - 25°C)。如果不直接進(jìn)行解凍，請(qǐng)將細(xì)胞置于干冰或液氮容器中。
二、解凍細(xì)胞
注意：建議一次只解凍一個(gè)冷凍細(xì)胞小瓶，以防止在較高溫度下長(zhǎng)時(shí)間暴露于 DMSO。
2.可 用 70% 乙醇或異丙醇擦拭細(xì)胞瓶的外部。
3.在生物安全柜中，將蓋子擰四分之一圈以釋放內(nèi)部壓力，然后重新擰緊。
輕輕旋轉(zhuǎn)小瓶，在 37°C 水浴中快速解凍細(xì)胞。當(dāng)仍有少量冰時(shí)，取出小瓶。這大約需要 1 - 2 分鐘。
三、細(xì)胞洗滌和計(jì)數(shù)
注意：重要的是在以下步驟中快速工作以確保高細(xì)胞活力和恢復(fù)。
用 70% 乙醇或異丙醇再次擦拭小瓶的外部。
在生物安全柜中，使用 2 mL 血清移液器測(cè)量細(xì)胞懸浮液的總體積。該值在步驟 13 中用于計(jì)算提供的單元格總數(shù)。將細(xì)胞放回小瓶中以混合懸浮液。
取出 20 μL 等分的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果使用臺(tái)盼藍(lán)評(píng)估活力，對(duì)于 ≥ 1 x 10 6 個(gè)細(xì)胞，至少添加 20 µL 培養(yǎng)基并記錄添加的培養(yǎng)基體積。對(duì)于 < 1 x 10 6 個(gè)細(xì)胞，直接用 20 µL 臺(tái)盼藍(lán)稀釋。將稀釋的等分試樣放在一邊，直到第 13 步。
重要提示：必須對(duì)解凍后（洗滌前）立即收集的等分試樣進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。這將確認(rèn)提供的細(xì)胞數(shù)量，并跟蹤洗滌過(guò)程中潛在的細(xì)胞損失。在洗滌步驟中，預(yù)計(jì)細(xì)胞損失高達(dá) 30%。
使用移液器將剩余的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 50 mL 錐形管中。
用 1 mL 培養(yǎng)基沖洗小瓶并將其逐滴添加到細(xì)胞中，同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn) 50 mL 管。
通過(guò)逐滴添加 15-20 mL 的介質(zhì)進(jìn)行清洗，同時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)管子。
在室溫 (15 - 25°C) 下 以 300 x g 離心細(xì)胞懸液10 分鐘。
如果使用臺(tái)盼藍(lán)，對(duì)第 8 步稀釋的等分試樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
用移液器小心地去除上清液，留下少量培養(yǎng)基以確保細(xì)胞沉淀不受干擾。輕輕彈動(dòng)試管重懸細(xì)胞沉淀。
如果細(xì)胞開(kāi)始結(jié)塊，每毫升細(xì)胞懸浮液加入 100 µg DNase I 溶液，并在室溫下孵育 15 分鐘。
注意：如果細(xì)胞將用于 DNA 或 RNA 提取，請(qǐng)勿添加 DNase I 溶液。
輕輕地將 15-20 mL 的介質(zhì)添加到管中。
在室溫下 以 300 x g 離心細(xì)胞懸液10 分鐘。
用移液器小心去除上清液，留下少量培養(yǎng)基以確保細(xì)胞沉淀不受干擾。輕輕彈動(dòng)試管重懸細(xì)胞沉淀。
解凍后的 細(xì)胞即可用于下游應(yīng)用。
蘇州阿爾法生物14年專(zhuān)注于生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)室設(shè)備及實(shí)驗(yàn)室耗材和試劑供應(yīng)，包括振蕩培養(yǎng)箱、生物反應(yīng)器、發(fā)酵罐、移液器、PCR儀、光學(xué)顯微鏡等，集實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)規(guī)劃、實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、生物實(shí)驗(yàn)器材供應(yīng)、售后服務(wù)為一體的一站式供應(yīng)。
