熒光定量pcr常見問題的可能原因與解決方案

　　無Ct值或Ct值延遲出現(xiàn):擴(kuò)增曲線信號不佳，曲線不平滑:標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。

　　1.擴(kuò)增產(chǎn)物大小不合適：實時熒光定量PCR擴(kuò)增片段的長度通常在80-150 bp之間，如果調(diào)整反應(yīng)的時間有可能擴(kuò)增500bp的片段。

　　2.PCR反應(yīng)過程中退火及延伸的時間過短或過長：應(yīng)根據(jù)擴(kuò)增片段的大小予與調(diào)整。

　　3.MgCl,濃度不合適：按0. 5mm的間距調(diào)整MgCI2的濃度。

　　4.循環(huán)數(shù)設(shè)置不足：最少設(shè)置35個循環(huán)，可以增加到45個循環(huán)。超過45個循環(huán)以上背景信號會增加，對實驗結(jié)果的分析造成干擾。

　　5.在錯誤的PCR反應(yīng)步驟采集信號：應(yīng)檢查程序設(shè)置確保信號的采集是在退火的步驟進(jìn)行的。

　　6.加樣的誤差及錯誤：注意每次加樣的一致性及移液器的校正。

　　7.DNA模板的起始濃度過低，不能被檢測出來：如果模板的濃度未知，最初的實驗可以采用較高濃度的模板并進(jìn)行梯度稀釋。最高的模板濃度不超過500ng基因組DNA。

　　8.模板DNA的降解：使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板是否降解，檢查DNA模板的儲存條件是否合適，如果確認(rèn)降解應(yīng)重新制備新鮮的DNA模板。

　　9.梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品的方法不規(guī)范:應(yīng)注意梯度稀釋樣品的操作規(guī)范，準(zhǔn)確。

　　10.引物或探針設(shè)計有誤，存在二級結(jié)構(gòu)：通過瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果，是否有PCR產(chǎn)物存在。如果沒有PCR擴(kuò)增產(chǎn)品，應(yīng)使用引物設(shè)計軟件檢查引物的各種指標(biāo)是否合適: Tm. 與模板的批配度、 二級結(jié)構(gòu)、擴(kuò)增片段的長度、非特異型擴(kuò)增的情況。具體的數(shù)據(jù)請翻閱前面的相關(guān)原理說明

　　11.引物之間的Tm值相差過多：上下游引物的Tm值差不應(yīng)超過4C。

　　12.引物或探針的使用濃度不合適：應(yīng)將濃度控制在50- 900 nM之間，探針的濃度低于引物的濃度。

　　13.引物或探針降解：使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板是否降解，檢查DNA模板的儲存條件是否合適，如果確認(rèn)降解應(yīng)重新制備新鮮的DNA模板。

　　14.探針設(shè)計的位置在擴(kuò)增片段的5’端：應(yīng)將探針設(shè)計的位置靠近擴(kuò)增片段的3”端

　　15.探針被氧化：避免用酸性溶液溶解探針，否則會產(chǎn)生高背景熒光信號及低的擴(kuò)增信號。推薦的緩沖液是pH8.0的TE緩沖液中。