傳代培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一，也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋，分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長。這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實驗所需。傳代要在嚴(yán)格的無菌條件下進行，每一步都需要認(rèn)真仔細(xì)的無菌操作。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。本實驗以傳代大鼠骨髓充間質(zhì)干細(xì)胞為例進行細(xì)胞傳代的步驟做一介紹。

一、傳代前準(zhǔn)備

實驗開始前，將無菌培養(yǎng)瓶、15ml 離心管、移液管、槍頭等放入無菌超凈工作臺，紫外線照射 30min，以進行工作臺的消毒。

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。

二、胰蛋白酶/EDTA 消化

    從培養(yǎng)箱中取出待傳代的細(xì)胞，75%酒精進行瓶口消毒，吸掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。PBS緩沖液洗去殘留的舊培養(yǎng)基,重復(fù)洗兩次。

棄去 PBS,按每 25 平方厘米 1ml 消化液比例加入消化液，消化液中 EDTA 濃度視不同細(xì)胞而定，骨髓干細(xì)胞貼壁特性強，比較難于消化，

可提高 EDTA 濃度的方法，本實驗采用0.25%胰蛋白酶加 0.1%EDTA 的消化液證明可以很好地消化，并不會損傷細(xì)胞。放入顯微鏡

下觀察，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺內(nèi)，加入 6ml 細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。消化時間為 1-5 分鐘，具體依細(xì)胞而異。

采用無菌吸管輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有細(xì)胞懸液放入一干凈的 15ml 離心管內(nèi)。每分鐘 800 轉(zhuǎn)，室溫離心 5min。

三、細(xì)胞傳代的步驟-制備細(xì)胞懸液及培養(yǎng)  

   吸棄上清液，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。向離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀加入適量培養(yǎng)基。吹打混勻，吹打過程中盡量不要產(chǎn)生氣泡。

顯微鏡下觀察細(xì)胞分散情況，避免出現(xiàn)細(xì)胞成團情況，確定為單細(xì)胞懸液方可進行下一步操作。本實驗以 1:2 的比例進行分瓶，通常骨髓充間質(zhì)干細(xì)胞一般以 1：3 傳代，傳到第 3 代時，骨髓干細(xì)胞的純度可達 95%以上。將培養(yǎng)瓶放入 37℃，5％CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

四、結(jié)果觀察

  第二天可觀察細(xì)胞貼壁生長情況，細(xì)胞培養(yǎng)換液時間一般為 2～3d，根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。待細(xì)胞鋪滿器皿底面，即可使用，也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。

懸浮細(xì)胞可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養(yǎng)液即可。

   當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時，可以將懸液移到離心管內(nèi)，1000～1500rpm離心 3 分鐘，棄上清，加入約 2ml 培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加 2-3 滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

五、傳代細(xì)胞培養(yǎng)的實驗步驟及注意事項

1、嚴(yán)格無菌：

傳代培養(yǎng)時要注意嚴(yán)格的無菌操作，并防止細(xì)胞之間的交叉污染。

2、適度消化：

    消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，酶解消化過程中要不斷觀察，消化過度會對細(xì)胞造成損害，消化不夠則難于將細(xì)胞解離下來。對于貼壁能力較弱，容易脫壁的細(xì)胞，可以不經(jīng)蛋白酶原消化處理和終止消化這兩步，直接對原代培養(yǎng)物或經(jīng)漂洗后用吸管進行吹打使細(xì)胞脫離瓶皿底壁。這種直接吹大的方法對生命力旺盛的細(xì)胞如某些腫瘤細(xì)胞較為合適。高強度機械吹打易對細(xì)胞造成傷害較大，細(xì)胞也常有較大數(shù)量的丟失，因而絕大部分貼壁生長的細(xì)胞需消化后才能吹打，一般不單獨采用高強度機械吹打。

3、把握好消化液的*佳濃度：

   消化液的消化能力是和溶液的 pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有 Ca2+, Mg2+和血清等因素有關(guān)，實驗采用 0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA 的消化液證明可以很好地消化骨髓干細(xì)胞。

4、吹打細(xì)胞動作要輕柔：

    吹打時用力過猛會損傷細(xì)胞?？蛇x擇用用大口徑的吸管或者管口較大的一次性耗材，減少對細(xì)胞的損傷。對貼壁細(xì)胞消化后的吹打過程要有序進行，要從一邊開始到另一邊結(jié)束，尤其是器皿的四角處，確保瓶皿底壁各處的細(xì)胞都被吹打脫離。

5、傳代次數(shù)不宜過多：

    傳代數(shù)是指對培養(yǎng)物傳代的次數(shù)，它不等于細(xì)胞分裂的次數(shù)或細(xì)胞的代數(shù)，而僅代表傳代操作的次數(shù)。傳代對細(xì)胞的影響或傷害程度僅次于將活細(xì)胞從生物體內(nèi)取出并進行原代培養(yǎng)的程度。只是因為傳代后的細(xì)胞生長并不像剛開始原代培養(yǎng)時那樣緩慢。每經(jīng)過一次傳代，細(xì)胞的生長環(huán)境就相應(yīng)發(fā)生一次較大變化。體外生長的細(xì)胞若處于動蕩的生活環(huán)境中，細(xì)胞的遺傳特性往往容易發(fā)生改變。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，往往容易轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞。因此，傳代對細(xì)胞生長和性狀會產(chǎn)生不利影響，一般情況下要盡可能減少傳代次數(shù)。

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