細胞計數(shù)是確定培養(yǎng)中鋪板的細胞濃度、確定細胞活力和評估細胞分離程序結(jié)果的一個組成部分。建議在細胞分離之前進行初始細胞計數(shù)；然后可以將該數(shù)字與細胞分離后的細胞計數(shù)進行比較，以計算細胞恢復率。此外，當預期細胞活力可能會降低時，應(yīng)進行活細胞計數(shù)，例如，在處理冷凍保存的細胞或離體操作的細胞時。

    可以使用臺盼藍或3% 乙酸和亞甲藍進行細胞計數(shù). 進行總有核細胞計數(shù)時，建議使用 3% 乙酸和亞-CH3藍。乙酸溶解細胞膜，亞甲藍染色暴露的細胞核。由于成熟的紅細胞缺乏細胞核，因此在計數(shù)時被排除在外?；蛘?，建議使用臺盼藍來計數(shù)活的哺乳動物細胞。臺盼藍穿透細胞膜，因此它進入細胞膜受損的細胞（死細胞）的細胞質(zhì)，將它們?nèi)境伤{色?；罴毎３滞暾?，可以通過排除藍色染料的能力與死細胞區(qū)分開來。在這種情況下，人們將計算完整的活細胞。

   本文描述了如何使用 3% 乙酸和亞-CH3藍進行總有核細胞計數(shù)，以及如何通過臺盼藍染料排除進行活細胞計數(shù)。

材料準備：

3% 乙酸和亞-CH3藍（或臺盼藍

96 孔板（例如 Corning® 96 孔圓底微孔板，貨號 #38018）或微量離心管（例如 Costar® 微量離心管，貨號#38090）

血細胞計數(shù)器（血細胞計數(shù)板）和蓋玻片

70% C2H6O

移液器（例如瑞寧移液器）

實驗步驟和方法：

第一部分：樣品制備

選項 1：用 3% 乙酸和亞-CH3藍對總有核細胞計數(shù)進行細胞稀釋

  使用磷酸鹽緩沖鹽水或無血清培養(yǎng)基對充分混合的單細胞懸浮液進行適當稀釋。為了準確表示濃度，請使用至少 20 μL 的細胞懸浮液進行稀釋。

示例：制備 10 倍稀釋液

在微量離心管或 96 孔板的孔中加入 180 μL 的 3% 乙酸和亞-CH3藍。混合細胞懸浮液，將 20 μL 添加到含有 3% 乙酸和亞-CH3藍的試管或孔中。

選項 2：通過臺盼藍染料排除對活細胞計數(shù)進行細胞稀釋

 確保要計數(shù)的細胞懸浮液*重新懸浮。在細胞沉降之前，將適量的細胞懸液 (20-200 μL) 放入離心管中。加入等體積的 0.4% 臺盼藍并輕輕混合。將混合物在室溫 (15°C – 25°C) 下孵育 5 分鐘。

第二部分：使用血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)

   通過用 70% C2H6O清潔腔室表面來制備血細胞計數(shù)器。擦干。將蓋玻片放在腔室上。

 使用 20 μL 移液器重新懸浮細胞混合物，并將 10 μL 的染色細胞放入血細胞計室。

注意：小心不要移動蓋玻片。允許毛細作用將樣品吸入。

 將血細胞計數(shù)器放在雙目光學顯微鏡的載物臺上。將顯微鏡調(diào)整到 10 倍放大倍率并聚焦在細胞上。

 使用手動計數(shù)計數(shù)器，計算血細胞計數(shù)器四個外部正方形中的每一個中的細胞（染色的細胞核）（圖 1A），包括位于底部和左側(cè)周邊的細胞，但不包括位于頂部和右手邊（圖 1B）。如果在第一部分中使用了 3% 乙酸和亞-CH3藍，則計算染色的細胞核。如果在第一部分中使用了臺盼藍，則計算未染色的活細胞。

圖 1.血細胞計數(shù)器網(wǎng)格線

血細胞計數(shù)器圖指示（A）四組紅色和（B）其中一組應(yīng)用于計數(shù)的 16 個方塊。

注意： 適當?shù)南♂屜禂?shù)將取決于起始樣本中存在的大致細胞數(shù)量，但應(yīng)使血細胞計數(shù)器中的細胞濃度為每平方（即大或主要正方形）50-100 個細胞。如果血細胞計數(shù)器上每個主要正方形的細胞多于或少于大約 100 個，請使用更大或更小的稀釋因子制備新的稀釋樣品。

     血細胞計數(shù)器的九個主要方塊中的每一個都代表 0.1 mm 3的總體積。由于 1 cm 3相當于 1 mL，因此可以使用以下等式確定細胞濃度：

有核細胞總數(shù)/mL = 每平方平均細胞數(shù) x 稀釋因子 x 10 4

示例：如果四個外部方塊中的每一個的細胞計數(shù)在 100 稀釋因子下分別為 21、15、20 和 17，則平均細胞計數(shù)將為 (21 + 15 + 20 + 17) ÷ 4 = 18.25。

因此，原始懸浮液中細胞的總濃度為：18.25 x 100 x 10^4 = 18,250,000 個細胞/mL。

使用人工的細胞計數(shù)方法誤差率較高，為提高細胞計數(shù)的準確度和細胞計數(shù)效率可以使用全自動細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)。博大博聚旗下的全自動細胞細胞計數(shù)儀系列，具有多種規(guī)格供選擇，可以滿足不同的用戶需求。

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