Southern Blot印跡定義：涉及將凝膠上分離的特定 DNA、RNA 或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到載體膜上以進(jìn)行檢測(cè)或鑒定的分析技術(shù)稱為印跡。
變性片段從凝膠中轉(zhuǎn)移到載體膜上的過程使其易于使用探針或抗體進(jìn)行分析。
根據(jù)要分離的物質(zhì)，印跡技術(shù)可能是——Southern印跡、Northern印跡或Western印跡，它們分別分離DNA、RNA和蛋白質(zhì)。
Southern Blot是一種用于分子生物學(xué)、免疫遺傳學(xué)和其他分子方法的分析技術(shù)，用于從 DNA 樣品的混合物或 DNA 鏈中的特定堿基序列中檢測(cè)或鑒定感興趣的 DNA。
該技術(shù)由分子生物學(xué)家 EM Southern 于 1975 年開發(fā)，用于分析 DNA 限制性片段中的相關(guān)基因，因此以他的名字命名為 Southern Blot 印跡。
Southern Blot 原理
該過程包括將電泳分離的 DNA 片段轉(zhuǎn)移到通常是NC的載體膜上，然后通過探針雜合檢測(cè)目標(biāo) DNA 片段。雜合是指在單鏈DNA探針和單鏈靶DNA之間形成雙鏈DNA分子的過程。由于探針和目標(biāo) DNA 是互補(bǔ)的，因此反應(yīng)是特異性的，有助于檢測(cè)特定的 DNA 片段。
Southern Blotting 的基本步驟
從細(xì)胞中提取和純化 DNA
1.按照基因組 DNA 提取的標(biāo)準(zhǔn)方法從靶細(xì)胞中分離 DNA，然后進(jìn)行純化。
2.限制性消化或 DNA 片段化
3.限制性內(nèi)切酶用于將高分子量 DNA 鏈切割成更小的片段。可以使用一種或多種限制酶來獲得這樣的片段。
4.電泳分離
可以通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，其中帶負(fù)電的 DNA 片段向帶正電的陽極移動(dòng)，移動(dòng)的距離取決于其大小。
5.脫嘌呤
部分脫嘌呤是通過使用稀釋的 HCl 完成的，它通過將 DNA 片段分解成更小的片段來促進(jìn)更高效率的轉(zhuǎn)移。
6.變性
然后用弱堿（例如 NaOH 的堿性溶液）使 DNA 變性。這導(dǎo)致雙鏈 DNA 變成單鏈，使其適合雜合。然后用 NaCl 中和 DNA，以防止在添加探針之前再次雜合。
7.印跡
然后將變性片段轉(zhuǎn)移到pvdf或NC膜上，這是通過將凝膠放在緩沖液飽和濾紙頂部，然后將NC濾膜放在凝膠頂部來完成的。最后將一些干燥的濾紙放在膜的頂部。碎片通過毛細(xì)作用被拉向NC膜并導(dǎo)致凝膠的接觸印跡。
8.烘烤
將NC膜從印跡疊層中取出，將附著有單鏈 DNA 條帶的膜在真空中或在 80°C 的常規(guī)烘箱中烘烤 2-3 小時(shí)或暴露在紫外線輻射下以固定狀態(tài)附著轉(zhuǎn)移的 DNA到膜上。
9.雜合
然后將膜暴露于雜合探針，該探針是具有特定序列的單個(gè) DNA 片段，其在目標(biāo) DNA 中的存在將被確定。探針 DNA 被標(biāo)記以便可以被檢測(cè)到，通常通過結(jié)合放射性或用熒光或顯色染料標(biāo)記分子。
10.洗滌未結(jié)合的探針
雜合后，用緩沖液*清洗膜以去除非特異性結(jié)合的探針或存在的任何未結(jié)合的探針。
11.放射自顯影
通過將NC膜與顯示雜合DNA分子的照相膠片接觸，通過放射自顯影檢測(cè)雜合區(qū)域。在使用放射性或熒光探針的情況下，通過放射自顯影在 X 射線膠片上顯示雜合模式，如果使用顯色檢測(cè)方法，則通過在膜上顯色來觀察雜合模式。
Southern 應(yīng)用
l 識(shí)別 DNA 樣本中的特定 DNA。
l RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）圖的制備
l 檢測(cè) DNA 中的突變、缺失或基因重排
l 用于識(shí)別 DNA 指紋識(shí)別 (VNTR)
l 轉(zhuǎn)基因個(gè)體中轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)與鑒定
l 限制位點(diǎn)的映射
l 用于傳染病診斷
l 癌癥的預(yù)后和遺傳病的產(chǎn)前診斷
l 測(cè)定限制性片段的分子量并測(cè)量不同樣品中的相對(duì)量。
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